亲子鉴定PCR的碱基错配

有没有人做产前亲子鉴定信息点位0错配的？竟然没有一个错配！那为什

这种错误概率极低

化学裂解错配碱基法有什么原理？化学裂解错配碱基法有什么原理?

其原理是末端标记的DNA片段暴露于可以识别并修饰异源双链中错配碱基的化学试剂中（如错配的胞嘧啶可被羟胺修饰，错配的胸腺嘧啶可被四氧化锇修饰），被修饰的位点随即可被杂氮环已烷等化学物质裂解

网友：亲子鉴定PCR的碱基错配

我们的生命体是个复杂而精妙的系统，而基因是构成生命的基本单位，生命体的生、长、病、衰、老、死都与基因有关。而基因有个特别有意思的功能，叫做“错配修复”（MMR，mismatch repair），这种修复机制能够帮助DNA在复制或重组时准确地识别和修复过程中产生的碱基错配，从而保证遗传的稳定性。

这是生命体的一种“自我矫正”功能。

火箭在发往月球的过程中，只有3%的时间是对准目标的，而其余97%的时间都是在根据目标不断修正自己的运行轨迹。这是火箭的“自我矫正”。

司马光小时候是个贪玩爱睡的孩子，为了改掉贪睡的坏毛病，司马光用圆木头作了一个警枕，每天早上一翻身，头滑落在床板上，自然惊醒，从此他天天早起读书，坚持不懈，终于成为了一个学识渊博的人，完成了史上著作《资治通鉴》。这是司马光的“自我矫正”。

清朝初期的史学家万斯同小时候也是一个顽皮孩子。由于贪玩且易怒，他掀翻了宾客们的桌子，被父亲关到了书屋里。万斯同从生气、厌恶读书，到闭门思过，并从《茶经》中受到启发，开始用心读书。经过长期的勤学苦读，他终于成为一位通晓历史遍览群书的著名学者，并参与了我国重要史书《二十四史》之《明史》的编修工作。这是万斯同的“自我矫正”。

“自我矫正”它的第一个关键词在于“自我”，它强调了一个人善于发挥自己作为主体的力量，无论他是单凭个体的能力，还是依靠主动求助外界人和物质资源达到一定目的，他的行为动机是由“自我”力量进行驱动的。

然而“自我矫正”机制在人的发展过程中慢慢被弱化和遗忘。反观大多数人，懒得撬动自我激发的这跟弦，他们总是企图在外界找答案。

他们情愿掏大把钞票去另一座城市上动辄几万元的线下课程，期待有高人大师帮自己撩拨出慧根，也不愿意通过自我努力到那些早已蕴涵一切机关的好书、好电影里逐步地打通自己的任督二脉。

缺乏自我矫正机制的人还有一种外在表现是受害者心态，他们归咎于从小的体制教育无法触发天性、激活活力，他们抱怨父母给到的原生家庭环境限制自由、无法让自己做人生决定。他们对父母言听计从的越厉害，内在心灵就越扭曲，他们反抗抱怨得越强烈，最后越是被硬生生地折断。

他们没有意识到，虽然原生家庭和学历教育是我们被动接受的、自己无法改变，但是我们还可以通过自主学习，自主探寻外在资源，从而获得人生的改变和升级。在他们的意识概念里，“自我”是不被看见的，是极其渺小、微不足道的。

自我矫正首先在于唤醒“自我”的意识。

“自我”这个词，它给我极大的触动来自于它让我找回了一种对生命的掌控感，不会颠沛流离于外在环境而怅然若失。

美国文学家及哲学家亨利·戴维·梭罗说：“最令人鼓舞的事实，莫过于人类确实能主动努力以提升生命价值”。自我意识被唤醒最核心的一点在于：让人看到希望。心理学博士陈海贤老师在其《自我发展心理学》的课程开篇也提到，人有能力实现自我突破。

王阳明小时候也很忤逆，但他真正转折点是在18岁时见到娄亮，娄亮和他说了一句话：“圣人必可学而至”，这仿佛一缕光照进王阳明心田，他觉得自己只要通过学习也可以成为圣人，让他看到学能成就自我的希望。

想起我在小的时候，就早早地被激发起了“自我”意识。记得从幼儿园开始到小学一年级，我爸爸一直扮演着教导我学业功课的辅导者角色。然而直到二年级的有一天，我爸爸突然语重心长地对我说：“往后的数学越来越难了，爸爸的文化程度恐怕是教不动你了，得靠你自己努力了”。说实话，当时听到这句话时，我的自我效能感油然而生，我心想，“我要超过我爸爸了”。从此以后，我爸在我的课业上扮演的角色从保姆型的检查陪练转变为了心理调适教练，而我也完全戒除了对爸爸在课业辅导上的依赖，成为了“相信自己能行”的人。

《银河补习班》里说，人生就像射箭，梦想就像箭靶子，如果连箭靶子都找不到在哪，每天拉弓有什么意义？事实上是，每天拉弓已经很累了，如果告诉我，以我目前的水平，就算每天拉弓朝着箭靶子射上十年也不可能中的，那我十之八九是不会继续拉弓的。但如果告诉我，我只需勤加练习、掌握方法，我是有很大可能性正中靶心，那么我拉弓的动力就会强一百倍。

这就是“自我矫正”的意义，它在于给人树立一种信念和希望，它帮人发现“自我”的力量，即每个人都有能力成为自我的向导、设计者和改造者，通过科学正确的方法实现自我成就。

“自我矫正”这个词的另外两个关键字分别是“矫”和“正”。“矫”这个字，是指认识到自我行为或能力与普世价值观或特定行业职业标准之间存在偏差，从而不断改变自我行为的过程。“正”强调了这个正确的目标或者结果，我们一切的矫正行为的目的和结果都是为了更加贴近或实现它。

将“自我矫正”这个词拆解成“自我”、“矫”、“正”三个部分，其实它们正好对应了自我矫正方法的三个关键要素：认识情境、改变行为和强化结果。

以下仅举例我是如何完成一次自我矫正，从而来说明自我矫正方法中的这三个要素。

如果说你想要改变自己的某种行为，最重要的并不是死盯着这个行为本身，而是要充分了解导致这种行为发生的原因究竟是什么。

每天早起后到上班的一段时间里，我都会陷入一段“狂躁”的状态：因为孩子赖床不起而抓狂、因为孩子起床后还蹲在客厅玩玩具而抓狂、因为孩子慢悠悠地摆弄袜子不穿上而抓狂、因为孩子吃饭时太慢挑食闹情绪而抓狂......

我曾把这些归咎于孩子缺乏时间概念和自我管理能力、甚至归咎于孩子开始出现了叛逆，已经叫不动、听不进话了。

然而，每当我们开车在路上终于能暂且平静下心情来的时候，我总是发觉自己刚刚的反应太过火，常常为此后悔不已，我问自己，难道没有更好的办法了吗？

鉴于我是一个善于觉察的人，于是我采用了“三行觉察日志”的方式：

这种早晨着急上火的情绪状态通常发生在工作日的早上，因为上班上学都要赶时间，这时候孩子的一点点“异常”的行为都会被无限放大和无法被容忍——这是问题产生的情境。

为了催促孩子，情急之下只能采取下策用吼。于是这导致好几个早晨，孩子被大人们群起而攻之，我们全家都是在厉声责骂中渡过的——这是情境导致的行为。

而我事后为自己的反应“过火”感到自责，亲子关系因此也有所产生裂痕，长久以往孩子总在责骂和抱怨声中长大，无益于孩子身心健康发展——这是问题造成的结果。

结果是行为自然而然的发展趋势，而行为是思维的产物、是某种特定情境下惯性使然的表现，于是我将问题源头锁定到情境。

我发现，的确在周末时间不紧急的情况下，我更有耐心应对孩子的各种需求。当我一旦平衡好时间和耐心的关系，问题就显得没那么棘手。使用“当……我是……”思考方式代替简单的“我是……”能让我们更加详尽、准确地理解自己。

自我矫正是意识到自己旧有的错误行为，介入新的行为，从而达到追求的目标和结果。这里，用新的行为代替旧的错误行为是关键，否则我们会陷入旧行为产生旧结果的死循环里。

这也许听起来很神奇，当我每次想要开口怒骂孩子的恼人行为时，我的内心会“bingo”一下，如果把打和骂替换成爱的拥抱、换成亲昵的碰碰脑袋、或者温柔的话语，那会怎样？我告诉自己：改变的机会来了。我把责备的怒吼转换成温柔的爱语：妈妈再爱你一下，你可不可以试着...，妈妈耐心等你。每当我态度这么柔软下来时，孩子的倔脾气立刻像胀满气的刺豚瞬间瘪了下去，要么很接纳顺从地听了我的话，要么也会心平气和地说出自己不这么做的理由，和我实现民主平等的交流。

改变行为的这个过程我把它看作“调频过程”。当我发出很焦虑、紊乱、急促的波频时，会影响周围环境的能量场，孩子作为信号接受者处在这样狂躁的环境中自然会受影响变得很易怒。而当我把频率调成稳定、平和时，对方的态度也会随之变得平静。

这个道理适用于我们所触及的一切环境和事物，当你发现生活中有些事情不那么顺利的时候，就要想想，是不是我发出频率不对，那么就要及时暂停，用新的频率替代旧有的错误频率，让一切从我们自身开始自然地改变。

在自我矫正的过程中，当看到新建立的行为带来良好的改变，我们就希望乘胜追击、一直保持下去，这时候就需要进行强化管理。

我采取的两个策略分别是：巩固和创造情境条件，对正确的新行为进行奖赏。

我知道时间紧迫是我早晨情绪的引爆点，那么尽可能提前起床时间，为自己的耐心留有充分余地。我可以选择锻炼孩子自己穿衣，也可以亲昵地帮助他完成一些动作，总之一切尽在掌握。

同时强化气氛和谐、高效能的早晨对我和对孩子的情绪滋养作用，比如，我们可以一起不慌不忙地、有条不紊地完成穿衣洗漱、吃早餐，不用消耗任何坏情绪，在车上马上可以进入亲子阅读状态，巩固美好的亲子时光。

甚至我会有意识地拿出三行觉察日志，仔细回顾今天是否有发脾气，哪些小事会引起我的情绪波动，今天的情绪状态是否平稳，以此提醒自己今天又完成了一件重要的自查和改进。

生活就像打场球赛，自我矫正给人最大的正念作用在于，以前我们总是习惯于把球抛出去，而今球又重新回到我们自己的手里。你是愿意成为那个抛球者，还是成为那个控球者呢？

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分子诊断是IVD增速最快的子行业，且与国外技术差异最小。分子诊断技术门类多，目前最为成熟且应用最广的当属PCR。下面就PCR中最常用的突变阻滞扩增系统做个简单介绍。

ARMS中文名称为突变阻滞扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS），又称为等位基因特异性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR）。其基本原理为引物3′端碱基与模板完全互补配对时，引物能正常进行延伸。如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，即存在错配，引物延伸被抑制甚至是完全终止。

在基因检测中，利用ARMS原理可实现靶序列扩增的同时避免非目的片段的扩增。而这种非目的片段的扩增在PCR中通常称之为非特异性。非特异性易造成检测结果的假阳性，对基因检测结果解读造成不利影响。

为抑制这种非特异性，通常情况下，将ARMS引物3′端末尾一个碱基设置为与突变碱基互补，而引物与野生型模板在末尾碱基处存在一个错配，由于错配的存在，野生型模板的扩增效率很低甚至不进行扩增。在实际工作中，由于引物与野生型模板仅存在一个碱基的错配，在绝大多数情况下，野生型模板也可进行扩增，即出现非特异性。

为提高引物特异性，可在3′端倒数第2位或第3位碱基处额外引入一个错配碱基，使引物可正常扩增靶序列，而非目的片段不扩增。3′端碱基错配依据其强度可分为强错配（G/A、C/T、T/T）、中错配（A/A、G/G、C/C）和弱错配（C/A、G/T）。如3′末端为“强错配”，则需要引入一个“弱错配”；如3′末端为“弱错配”，则需要引入一个“强错配”。

二、提高ARMS引物特异性的方法

然而，某些引物除3′末端错配外，额外引入一个错配并不能完全抑制非特异扩增。特别地，在体外诊断试剂研发中，对特异性要求高，需要使用其他方法提高特异性。

1、 提高PCR程序退火温度。一般情况下退火温度和特异性存在如下关系：退火温度高，特异性越好，退火温度低，特异性越差。通过梯度PCR设置3~5个不同退火温度，筛选最适宜的PCR退火温度。

2、 添加PCR增强剂。某些PCR增强剂如四甲基氯化铵，可以提高引物和模板的特异性，一般在PCR反应液中其终浓度为10~50mM，不同引物最适宜用量不同，具体应用时需要根据实验进行调整优化。

3、 Blocker PCR技术。通过在PCR体系中加入Blocker序列来抑制野生型基因扩增，从而提高PCR特异性。Blocker为人工合成的一段单链核苷酸序列，Blocker与引物最大的区别在于其3′OH以3'-Spacer C3、3'-Phosphat、3'-ddC、3'-Inverted End进行修饰。由于其3′OH被封闭，因此，其不能参与PCR的延伸反应。在PCR退火阶段，Blocker序列与野生型模板完全互补配对，阻碍了PCR引物进一步与野生型模板结合，而Blocker序列与突变型模板存在1个碱基错配，在PCR过程中，PCR引物将优先和突变型模板互补配对。

值得一提的是，PNA钳（PNA Clamping）也是目前应用较为广泛的Blocker PCR技术。PNA是人工合成的聚合物，与DNA与DNA之间的结合相比，PNA与DNA结合更加牢固。PNA能够特异性与野生型模板结合，从而使野生型模板不能作为模板扩增；而突变型模板由于存在碱基错配，PNA不能与其结合，从而使突变型模板能够进行PCR扩增。

在产品设计和开发过程中，如果对产品特异性要求很严，特别是一些肿瘤靶向药物突变基因检测产品开发中，引物特异性通常不能直接满足产品设计要求，具体应用过程中，需要结合以上几种方法来提高体系特异性。当然，针对不同模板序列、不同突变类型，具体方法的应用效果存在较大差异，因此，具体效果还需要实验验证。

三、总结

总之，ARMS PCR灵敏度高，可检测低至1%的突变；成本较低，PCR体系中引物探针均可以商业化定制，对于工业客户，其合成成本更低；操作简单，时间快速，一般2小时即可获得检测结果。当然，ARMS PCR也存在天生的缺点，其检测通量低，只适合单基因或少数基因突变位点检测；只能针对已知突变进行检测，不能检测未知突变。尽管如此，但不得不承认，ARMS PCR是目前分子诊断产品中应用最广泛的技术，没有之一。

本文将按检测的原理对半个世纪中临床常用的分子诊断方法进行归类,以分子杂交、核酸序列测定、分子构象变异与定量PCR 4大类对其历史沿革、技术原理与实践应用进行简要的介绍与评论,以更好的回顾过去,展望分子诊断领域的未来。

吴之源等丨检验医学

1961年Hall建立的液相分子杂交法标志着人类掌握分子生物学技术对特定核酸序列进行检测,开启了对疾病分子诊断的大门。1983年Mullis提出的聚合酶链反应(PCR)概念,更是给分子诊断技术插上了基因扩增的翅膀,大大提高了基因检测技术的敏感度与特异性,降低了分子诊断的技术门槛。

基于分子杂交的分子诊断技术

上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。

DNA印迹技术(Southern blot)

Southern[1]于1975年发明了DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等[2]于1977年推出基于转印杂交的Northern blot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。

ASO反向斑点杂交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)

使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986年,Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。

其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki[4]又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)

FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin[5]首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。

如今,FISH已在染色体核型分析,基因扩增、 基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)

MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1个碱基的差别,就会导致杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。

该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。

生物芯片

1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列,标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类,基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。

微阵列芯片

固相芯片：微阵列基因组DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史,其技术平台主要分为2类,即微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNP array)。顾名思义,aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较,直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。

随着技术的不断进步,目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证,使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%[8],表达谱芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。

类似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交,从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。相较于基因组杂交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测,对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;

液相芯片：传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列,而Luminex公司的xMAP技术[10]则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色,并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上,使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交,使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪,其中红色激光检测微球编码,绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。

微流控芯片

1992年Harrison等[11]首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想,通过分析设备的微型化与集成化,完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯片(microfluidic chip)由微米级流体的管道、反应器等元件构成,与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比,以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。

目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。

核酸序列测定

测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。

第1代测序

1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。

Sanger等[12]于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,DNA合成反应便会终止。如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP,则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自显影,根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。

Appied Biosystems公司在Sanger法的基础上,于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。Sanger测序是最为经典的一代测序技术,仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。

第2代测序

焦磷酸测序(Pyro-sequencing)

不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相[13]与液相[14]载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光,通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念,焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量,因此在SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同,其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。

高通量第2代测序

目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而,由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp),需要对数据进行大规模拼接,因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求,以利于后期的测序数据分析。

第3代测序

第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基因物质进行单分子检测,故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化,并最终投入临床应用仍有很长的距离。

基于分子构象的分子诊断技术

变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)

1970~1980年间,Fischer等[15]与Orita等[16]分别提出了利用核酸序列变异所导致双链变性条件差异与单链空间折叠差异,通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法,即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异,通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性,且对于序列的改变非常敏感,常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR后开盖电泳的操作,现已不常见于临床检测。

变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)

1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术,称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物,其经过变性和复性过程后,体系内将出现2种双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链;另一种为异源双链,即双链中1条单链为野生型,而另1条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链 DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因存在错配区而更易变性,被色谱柱保留的时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测,可快速检出<5%负荷的变异序列。但需注意的是,由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测,其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。

高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)

2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记,再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后,若存在序列变异杂合子,则形成异源双链,其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充,其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言,HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定,但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。

如何利用DNA构象对序列进行推测,从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。目前,使用构象变化对序列变异进行间接检测的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是,由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证,因此其只适合大规模的初筛,而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。

定量PCR(quantitative PCR,qPCR)

相比于其他分子诊断检测技术,qPCR具有2项优势,即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行,杜绝了PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染;同时通过动态监测荧光信号,可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势,qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术,在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但伴随着qPCR技术的迅猛发展,有关这项技术的质量管理问题也日益突出,如何消除各类生物学变量所引起的检测变异,减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。

实时荧光定量PCR(real-time PCR)

双链掺入法

1992年Higuchi等[20-21]通过在PCR反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定,提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线,定量反应体系中初始模板的反应动力学(real-time PCR)模型,开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA双链,且只有嵌入双链时才释放荧光,在每1次的扩增循环后检测反应管的荧光强度,绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线,以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cycle threshold,Ct),则Ct与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系,推断初始模板量。

随后Morrison[22]提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR Green I进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。这一方法操作简便,但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增,其产物特异性无法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验,但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测,因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。

Taqman探针

由于双链掺入法存在特异性较低的问题,1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5'核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针的概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。TaqMan探针的本质是FRET寡核苷酸探针,在探针的5'端标记荧光报告基团,3'端标记荧光淬灭基团,利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核苷酸探针,使荧光基团得以游离,释放荧光信号。从而使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光,通过real-time PCR的原理对其进行定量。由于其超高的特异性与成功的商品化推广,Taqman探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR方法,其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。

分子信标

同样在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信标(moleuclar beacons)进行qPCR的方法,分子信标是5'与3'端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针,其两端具有互补的高GC序列,在qPCR反应液中呈发夹结构,荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移(FRET)而保持静息状态。

当PCR反应开始后,茎环结构在变性高温条件下打开,释放荧光;在退火过程中,靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性,不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭,通过检测qPCR体系中退火时的荧光信号强度,便可以real-time PCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。相比于Taqman探针,分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合,大大降低了检测的荧光背景,其检测特异性较Taqman探针更高,更适合等位基因的分型检测。

双杂交探针

1997年,Wittwer等[25]发表了使用分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2条相邻寡核苷酸探针进行qPCR的方法。双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有一定重叠,且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2条探针与靶基因同时杂交时,供体与受体基因得以接近,从而通过FRET发生能量传递,激发荧光信号,荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2条探针进行靶序列杂交,该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。

数字PCR

早在上世纪90年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR反应进行分散检测的概念。基于这一理念,Vgelstein与Kinzter[26]于1999年发表了数字PCR(digital PCR)的方法,对结肠癌患者粪便中的微量 K-RAS基因突变进行了定量。相比于传统的qPCR方法,数字PCR的核心是将qPCR反应进行微球乳糜液化,再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中,保证每个反应孔中仅存在≤1个核酸模板。经过PCR后,对每个微反应孔的荧光信号进行检测,存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号,没有靶模板的反应孔就没有荧光信号,以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。因此,数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应,而非以模板Ct值进行核酸定量的real-time PCR。

经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是首款商品化的数字PCR检测系统,目前已被广泛运用于微量病原微生物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR相比较,该技术具有超高的灵敏度与精密度,使其成为目前qPCR领域的新星。

展 望

半个多世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。概而言之,在过去的50多年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升:即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化,操作方法由手工操作向全自动化转化,检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化;检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。

未来,我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入,分子诊断将会出现理念的革命性进步,高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。随着技术的进一步发展,传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学,也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。

对于传统人力与时间成本较高的检测方法学,将出现两极分化的态势,即Southern等经典的检测金标准将得到保留;而ASO-RDB等灵敏度、特异性均不能满足实际临床需求的方法将快速被新型技术所取代。最终,分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局面,形成由肿瘤学、遗传学、微生物学、药物基因组学四足鼎立,快速发展的景象。

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